鴿子飛行能力基因檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）使用說明書
【產(chǎn)品名稱】
通用名稱：鴿子飛行能力基因檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）
【預(yù)期用途】
本試劑盒用于鴿子飛行能力基因定性檢測，可對鴿子的飛行能力進行預(yù)測。
【檢測原理】
根據(jù)鴿子飛行能力基因設(shè)計特異性引物和探針，利用熒光定量PCR技術(shù)，通過檢測熒光的釋放和強度，來檢測飛行能力基因。
【試劑盒組成】
本產(chǎn)品由特異性引物探針、Taq酶以及反應(yīng)緩沖液組成。
【主要組成成分】
序號 | 組分 | 標示裝量 /管 | 數(shù)量 （管） |
1 | 10 x qPCR Buffer | 400 ul | 1 |
2 | dNTP(2.5mM) | 240 ul | 1 |
3 | Hot Star Taq (5u/ul) | 30 ul | 1 |
4 | LDHA引物探針 | 200 ul | 1 |
5 | DRD4a引物探針 | 200 ul | 1 |
6 | DRD4b引物探針 | 200 ul | 1 |
【儲存條件及有效期】
-20℃避光保存有效期為12個月；切忌反復(fù)凍融。
【樣本要求】
1、羽毛：采集胸部或腹部或腿部羽毛2根，切忌使用自然脫落的羽毛。
2、全血：使用EDTA作為抗凝劑，切忌使用肝素抗凝。要求使用新鮮全血，或在2～8℃保存不超過7天，或在-20℃以下保存不超過一個月，應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融。
【檢驗方法】
1、樣本處理與核酸提取，具體操作參照相關(guān)操作說明書。
（1）0.2ml PCR管中，加入羽毛2-4根，加入Reagent A 20ul（注意淹沒樣本），99℃加熱20分鐘；
（2）向上一步的Pcr管中加入Reagent B 100ul，5000rpm離心30秒-1分鐘，備用；
2、儀器準備將每臺儀器接通電源，檢查是否運轉(zhuǎn)正常。
3、物品準備：離心機、冰盒、移液器、吸頭；試劑準備（未分裝規(guī)格使用）：將PCR反應(yīng)液解凍、混勻，瞬時離心后分裝14μL/管。
序號 | 組分 | 用量 | 反應(yīng)液 |
1 | 10 x qPCR Buffer | 2 ul | 14ul反應(yīng)液 |
2 | dNTP(2.5mM) | 1.6 ul |
3 | Hot Star Taq (5u/ul) | 0.2 ul |
4 | 去離子水 | 10.2 ul |
管號1 | 管號2 | 管號3 |
14ul反應(yīng)液 | 14ul反應(yīng)液 | 14ul反應(yīng)液 |
4ul LDHA引物探針 | 4ul DRD4a引物探針 | 4ul DRD4b引物探針 |
2ul DNA模板 | 2ul DNA模板 | 2ul DNA模板 |
4、 PCR擴增條件（反應(yīng)體系為20μL）
擴增溫度 | 擴增時間 | 循環(huán)數(shù) |
95℃ | 5min | 1 |
95℃ | 15sec | 40 cycles |
60℃ | 30sec（采集熒光）FAM及VIC |
5、熒光定量檢測
結(jié)果判定
反應(yīng)液 | 飛行能力基因 基因型 |
野生基因型 | 雜合基因型 | 突變基因型 |
管號1 LDHA基因 | GG | AG | AA |
管號2 DRD4a基因 | CC | CT | TT |
管號3 DRD4b基因 | CC | CT | TT |
FAM VIC信號判斷 | VIC＜33，FAM無ct | FAM-VIC絕對值＜3 | FAM＜33，VIC無ct |
備注 | FAM可能有ct，FAM-VIC絕對值＞5 |
| VIC可能有ct，FAM-VIC絕對值＞5 |
【檢驗方法局限性】
本方法只適用于鴿子飛行能力基因檢測。
【產(chǎn)品性能指標】
1. 特異性：對特異性參考品進行檢測，所有參考品檢測結(jié)果陰性。
2. 準確性：對檢測范圍內(nèi)的不同基因型的參考品進行檢測，能檢出相應(yīng)基因型。
3. 最低檢出限：應(yīng)不高于5ng/μL。
4. 重復(fù)性：檢測范圍內(nèi)的不同基因型的重復(fù)性參考品，每個參考品進行10次檢測，結(jié)果能準確分型，且相應(yīng)檢測結(jié)果Ct值的變異系數(shù)（CV）應(yīng)≤5.0%。
5. 有效期：試劑盒于-20避光保存，有效期為12個月。
【注意事項】 實驗前請仔細閱讀說明書
1. 本試劑盒僅鴿子飛行能力基因體外檢測。有關(guān)實驗室管理規(guī)范嚴格按照行政主管部門頒布的有關(guān)基因擴增檢測實驗室的管理規(guī)定執(zhí)行。
2. 試劑盒應(yīng)低溫運輸和保存，試劑盒內(nèi)各試劑使用前，請短暫離心。
3. 檢測時，提取樣本必須在生物安全柜中進行，且使用時要注意橫向污染。
4. 實驗應(yīng)嚴格分區(qū)操作：第一區(qū)：試劑制備區(qū)—準備擴增所需試劑；
第二區(qū)：樣本處理區(qū)—待測樣本和對照品處理；
第三區(qū)：PCR擴增區(qū)—PCR擴增檢測。
本產(chǎn)品為一次性用品，使用后的試劑盒和樣本等廢棄物應(yīng)作為傳染源按照國家相關(guān)法律法規(guī)處理。
